La Biotecnologia è l'applicazione tecnologica che si serve di sistemi biologici, degli organismi viventi o di derivati di questi per produrre o modificare prodotti o processi per un fine specifico. Sulla base di tale definizione si può quindi affermare che gli esseri umani impiegano la biotecnologia da migliaia di anni per creare prodotti alimentari, tessili e altri beni necessari. Diversi prodotti a noi familiari, compresi il pane lievitato, lo yogurt, il formaggio, il vino, la birra e l’aceto, sono tutti ottenuti mediante la coltura di microrganismi.
Negli ultimi anni, tuttavia, il termine «biotecnologia» è divenuto sinonimo di impiego di tecniche di ingegneria genetica e di biologia molecolare che trovano applicazione in vari campi, dalla medicina all’agricoltura.
Amgen produce farmaci partendo da molecole già presenti nel corpo umano. La biotecnologia è il processo mediante il quale queste componenti naturali dell’organismo vengono prodotte in quantità sufficienti da consentirne un uso terapeutico.
Gli agenti terapeutici così ottenuti sono sostanzialmente identici ai materiali che si trovano in natura: solitamente si tratta di proteine che svolgono un ruolo fisiologico specifico. Per contro, i farmaci tradizionali sono prodotti mediante procedure di chimica organica sintetica e hanno spesso una minore attività specifica.
Nel creare i prodotti proteici, gli scienziati e i ricercatori di Amgen impiegano spesso tecnologie di ingegneria genetica, compresa quella del DNA ricombinante. Utilizzando batteri, lieviti o cellule animali in coltura, introducono le informazioni necessarie per produrre una proteina umana dotata di potenzialità terapeutiche. Una volta modificate, queste cellule possono essere coltivate in grandi quantità, facendo ricorso spesso all’antica tecnica della fermentazione.
Durante la fermentazione, organismi monocellulari quali lieviti e batteri crescono su substrati di zuccheri e amidi, producendo alcool, anidride carbonica e altri prodotti derivati. (Le bollicine che troviamo nella birra alcolica derivano da questo processo, così come i buchi che osserviamo nel pane e in alcuni formaggi.) Mentre fermentano, le cellule ingegnerizzate creano un altro prodotto importante, e in quantità eccezionali: la proteina umana desiderata. A seconda del tipo di ingegnerizzazione della cellula, la proteina si troverà all’interno delle cellule o nel mezzo circostante.
L’aggiunta di materiale genetico alle cellule fa sì che le proteine vengano definite «ricombinanti», ed è a esse che Amgen dedica gran parte del suo lavoro in campo biotecnologico.
Le origini della moderna biotecnologia risalgono a un centinaio di anni fa, in particolare al lavoro di Louis Pasteur, Robert Koch e Gregor Mendel. Pasteur e Koch gettarono le basi dell’attuale microbiologia, mentre Mendel fu il primo a descrivere le leggi dell’ereditarietà genetica. Numerosi scienziati tuttavia contribuirono ai progressi realizzati in questi campi.
Queste scoperte portarono agli inizi degli anni Cinquanta alla scoperta dell’acido desossiribonucleico (DNA), molecola fondamentale alla base di tutta la genetica. Poco dopo James Watson e Francis Crick determinarono per primi la struttura del DNA.
Le tecniche di inserimento di geni estranei nei batteri furono messe a punto inizialmente nei primi anni Settanta in diversi laboratori di varie università, comprese l’Università della California a San Francisco, l’Università di Stanford e l’Università di Harvard. Tali sviluppi gettarono le basi della successiva rivoluzione biotecnologica.
Il primo prodotto creato dalla moderna biotecnologia è l’insulina, un ormone proteico generato nel pancreas e utilizzato dall’organismo per regolare i livelli di zucchero nel sangue (glucosio). I pazienti diabetici non riescono più a produrre insulina e devono far ricorso a una fonte esterna per regolare adeguatamente il glucosio ematico.
L’insulina fu isolata per la prima volta dal pancreas di bovini e suini all’inizio degli anni Venti. Quest’insulina di origine animale si rivelò efficace nel trattamento di pazienti affetti da diabete e venne presto messa a loro disposizione. Tuttavia, poiché l’insulina di origine animale non era identica a quella prodotta dall’uomo, tra i medici cominciarono a crescere le preoccupazioni sui suoi effetti a lungo termine. Inoltre, poiché verso la metà degli anni Settanta il numero di pazienti diabetici continuava ad aumentare, la disponibilità di insulina animale a lungo termine divenne fonte di grande preoccupazione.
Questi fattori fecero dell’insulina il target ideale di un piccolo gruppo di biochimici e di biologi molecolari che si proponevano di applicare le nuove tecniche di ingegneria genetica alle malattie dell’uomo.
Nel 1978, nel suo laboratorio presso l’Università della California a San Francisco, Herbert Boyer riuscì a sintetizzare il gene dell’insulina umana e a inserirlo in un batterio, l’Escherichia coli. L’insulina, come tutte le proteine, è formata da una catena di “mattoni” chiamati aminoacidi. L’ordine degli aminoacidi all’interno di una proteina non è casuale, ma è tipico di quella particolare proteina. Quando si conosce la sequenza degli aminoacidi, è possibile isolare (o in questo caso sintetizzare chimicamente) la corrispondente sequenza di DNA e introdurla nelle cellule batteriche per produrre la proteina umana.
Per fare ciò, il pezzo di DNA estraneo è dapprima inserito in un plasmide, piccolo filamento circolare di DNA che funge da vettore. Il nuovo plasmide «ricombinante» che trasporta il gene umano viene poi reintrodotto in un’altra cellula batterica. Una volta all’interno della cellula, il gene umano contenuto nel plasmide può essere letto dalla «macchina» proteica della cellula.
All’epoca, l’approccio utilizzato da Boyer e dai suoi collaboratori per sintetizzare un gene era assolutamente rivoluzionario. Oggi tale approccio è più diffuso, benché si utilizzino abitualmente altri metodi per isolare il DNA umano, direttamente o indirettamente.
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Che cos’è un gene?
I geni sono formati dal DNA che codifica le informazioni di cui le cellule viventi hanno bisogno per produrre proteine. Negli esseri umani questo determina i tratti ereditari, come ad esempio il colore degli occhi o dei capelli. In microrganismi quali batteri e lieviti, i tratti genetici corrispondono generalmente alle caratteristiche biochimiche, ad esempio la capacità di crescere sul substrato di uno zucchero piuttosto che di un altro.
Il DNA di molti organismi, compresi gli animali, i lieviti e i funghi, si trova all’interno del nucleo cellulare. Tali organismi sono detti eucarioti, che significa «vero nucleo». Inoltre, nelle cellule eucariotiche il DNA può essere trovato anche in strutture più grandi, i cosiddetti cromosomi, osservabili al microscopio durante la fase di divisione cellulare.
Diversamente dalle cellule eucariotiche, le cellule batteriche non hanno un nucleo definito. A causa della mancanza di nucleo, i batteri sono classificati come un gruppo distinto di organismi detti procarioti.
Amgen ha sempre focalizzato il proprio interesse sulle proteine, le macchine molecolari della cellula. Le proteine svolgono diverse funzioni all’interno dell’organismo. Gli ormoni fungono da messaggeri cellulari, gli enzimi sono i mediatori del metabolismo cellulare, gli anticorpi e le linfochine costituiscono le principali componenti della risposta immunitaria dell’organismo.
In virtù della loro importanza biologica, le proteine possono divenire eccellenti farmaci candidati quando si sfruttano le loro funzioni naturali. I geni sono il punto di partenza essenziale su cui basarsi per creare proteine di interesse.
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Struttura del DNA
Come descritto in precedenza, le proteine sono codificate dai geni, che a loro volta sono composti da acido desossiribonucleico, o DNA. Il segreto di tale capacità è riconducibile alla famosa struttura a doppia elica scoperta da James Watson e Francis Crick nel 1953.
La doppia elica si riferisce alla forma del DNA, paragonabile a una scala a chiocciola. Nell’analogia della scala, la struttura esterna è costituita da molecole di zucchero e di fosfato, mentre i gradini sono formati da molecole note come «basi». Ciascuna unità contenente uno zucchero, un gruppo del fosfato e una base è chiamata nucleotide. Ogni gradino racchiude al suo interno un paio di basi unite da un legame chimico.
Il DNA contiene solo quattro basi specifiche: adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C). Le quattro basi si accoppiano solo in due combinazioni: A con T e G con C. Conoscere la sequenza delle basi su un lato (filamento) della molecola consente agli scienziati di stabilire la sequenza sull’altro lato.
Il DNA, come si notò quando venne osservata la sua struttura per la prima volta, ha la capacità intrinseca di essere copiato. Poiché l’adenina si accoppia sempre con la timina e la guanina con la citosina, ciascun filamento può fungere da stampo per produrre copie identiche della molecola. Quello che non si conosceva all’epoca era in che modo una molecola con una diversità limitata – solo quattro basi – potesse contenere le informazioni necessarie a produrre molecole estremamente diverse come le proteine.
Nel DNA le basi nucleotidiche formano un alfabeto semplice di quattro lettere che può codificare per i 20 aminoacidi contenuti nelle proteine. Il linguaggio del codice genetico comprende i codoni, cioè le «parole» dei singoli aminoacidi. Ciascun codone copre in lunghezza tre basi. Un gene può essere immaginato come una frase composta interamente da queste parole di tre lettere. A prima vista questo alfabeto può sembrare molto limitato. Tuttavia, utilizzando quattro lettere in combinazioni di tre è possibile ottenere 64 diverse combinazioni. Di fatto molti aminoacidi possono essere descritti utilizzando più di un codone.
Il meccanismo di base del codice genetico è simile in molti organismi. A causa di questa somiglianza è talvolta possibile prendere un segmento di DNA da una fonte e prevedere lo stesso comportamento in un'altra. Un segmento di DNA umano ad esempio può essere introdotto in un organismo ospite quale un batterio, inducendolo a produrre la proteina umana. È questa la chiave dell'ingegneria genetica.
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DNA, RNA e proteine
Quando la proteina viene prodotta nel citoplasma cellulare, le informazioni – il DNA – localizzate nel nucleo vengono trasferite utilizzando una molecola intermedia chiamata acido ribonucleico (RNA), più specificatamente un tipo di RNA chiamato RNA messaggero (mRNA). L’RNA ha una struttura molto simile a quella del DNA, ma con tre differenze fondamentali: lo zucchero costituente è il ribosio, la base uracile (U) sostituisce la timina (T) e nella maggior parte dei casi l’RNA ha un unico filamento. L’RNA messaggero si forma durante un processo chiamato trascrizione, che utilizza come stampo solo un filamento del DNA (chiamato filamento «senso»), il quale viene poi trasportato nel citoplasma dove viene letto, o «tradotto», in proteina.
Il processo di traduzione coinvolge organuli complessi nella cellula, chiamati ribosomi, nonché molecole di RNA chiamate RNA di trasporto (tRNA). I ribosomi fungono da impalcatura, mantenendo l’mRNA nella posizione corretta in modo che possa essere letto dai tRNA che trasportano gli aminoacidi. In tale processo gli aminoacidi sono legati assieme e formano la proteina che era originariamente codificata nel DNA.
Tecnologia del DNA ricombinante
Il termine «biotecnologia» si riferisce spesso alle tecniche del DNA ricombinante, una definizione quest’ultima che indica semplicemente il trasferimento di un gene da un organismo a un altro: letteralmente, la ricombinazione di DNA proveniente da diverse fonti.
Questo processo consiste nell’isolare un gene umano con potenziale terapeutico o nel modificare geneticamente un agente potenzialmente terapeutico per introdurlo successivamente in batteri, in lieviti o in linee cellulari animali. I sistemi ricombinanti vengono indotti a produrre la proteina in grandi quantità e in condizioni controllate. Siamo dunque in grado di produrre grandi quantità di una proteina altamente purificata da utilizzare per scopi clinici e terapeutici che rivestono da ultimo anche un interesse commerciale.
La tecnica del DNA ricombinante illustrata in precedenza è relativamente facile da comprendere. Utilizzando proteine chiamate enzimi di restrizione, i singoli geni estratti dal DNA umano, o modificati geneticamente in laboratorio, sono isolati e inseriti in piccoli frammenti circolari di DNA tagliati con lo stesso enzima, chiamati plasmidi. Una volta inserito nel plasmide, il gene può essere fissato utilizzando un altro enzima chiamato DNA ligasi. Gli enzimi di restrizione e i DNA ligasi sono le forbici e la «colla» della tecnologia del DNA ricombinante.
Costruito in questo modo, il plasmide ricombinante viene inserito in un batterio, un lievito o una cellula animale in coltura mediante un processo chiamato trasformazione.
Le cellule trasformate vengono separate da quelle non trasformate mediante un processo di selezione che sfrutta quei geni con espressione di farmacoresistenza, presenti anche nei plasmidi. Successivamente, mediante il processo di clonazione, si crea una popolazione pura di cellule ricombinanti. Durante tale processo viene selezionata una sola cellula che genererà poi, attraverso la normale divisione cellulare, un’intera popolazione di cellule identiche o cloni. Tutte le cellule così generate contengono una copia del plasmide che trasporta la sequenza inserita di DNA, mirante a produrre un potenziale agente terapeutico.
Una volta inserito il gene e clonata la linea cellulare, le cellule sono stimolate ad attivare, o «esprimere», la sequenza di DNA. A seconda del sistema cellulare prescelto, la proteina ricombinante prodotta può essere trovata all’interno delle cellule o all’esterno, nel mezzo circostante.
Spesso i pazienti affetti da nefropatia cronica non riescono a produrre quantità adeguate di eritropoietina, necessarie a mantenere le concentrazioni di eritrociti in circolo a livelli normali. Di conseguenza sviluppano generalmente una grave anemia cronica che si traduce in livelli costantemente bassi di globuli rossi nel sangue. In alcuni casi per mantenere adeguate concentrazioni di emazie, oltre alla dialisi questi pazienti devono sottoporsi a frequenti trasfusioni di sangue.
L'anemia associata alla nefropatia potrebbe essere sconfitta presumibilmente qualora si riuscisse a trovare una fonte esterna di eritropoietina. Sfortunatamente l’organismo produce eritropoietina in piccolissime quantità, ed è quindi impensabile isolare l’eritropoietina naturale sufficiente a trattare tutti i pazienti affetti da tale patologia. Epoetina Alfa è un esempio di come sia possibile applicare la tecnologia del DNA ricombinante per produrre un agente terapeutico destinato all’uomo.
Il futuro
La tecnologia del DNA ricombinante è stata la colonna portante del successo di Amgen Dompé. Mentre gli scienziati continuano a migliorare le tecniche di ricombinazione del DNA, nuovi metodi vengono messi a punto per sviluppare prodotti biotecnologici di seconda e di terza generazione.
Negli ultimi anni la comprensione dei processi di crescita e di differenziazione cellulare è migliorata in maniera straordinaria. Ci auguriamo che tali progressi portino allo sviluppo di nuovi prodotti per il trattamento di diverse patologie. Inoltre, l’approfondimento delle nostre conoscenze sulle proteine e sulla struttura del DNA ci ha permesso di creare nuove classi di molecole terapeutiche dotate di capacità uniche.
